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賽默飛熒光定量PCR儀使用方法

熒光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）是一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程、對(duì)目標(biāo)DNA或RNA進(jìn)行定量分析的分子生物學(xué)技術(shù)。賽默飛（Thermo Fisher Scientific）作為全球知名的科研儀器制造商，其熒光定量PCR儀以性能穩(wěn)定、檢測(cè)靈敏度高和數(shù)據(jù)處理功能完善而廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研、臨床檢測(cè)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，熟悉賽默飛熒光定量PCR儀的正確使用方法至關(guān)重要。

一、開(kāi)機(jī)與系統(tǒng)檢查

1. 檢查電源與儀器狀態(tài)
   確保儀器連接穩(wěn)定的交流電源，避免與大功率設(shè)備共用插座，防止電壓波動(dòng)影響實(shí)驗(yàn)。
   儀器通風(fēng)口保持暢通，避免堆放雜物。檢查儀器外觀和樣品槽是否清潔無(wú)異物。

2. 開(kāi)機(jī)啟動(dòng)
   按下電源鍵，等待系統(tǒng)自檢完成。啟動(dòng)過(guò)程中，儀器會(huì)進(jìn)行燈源、光路和溫控系統(tǒng)的自檢，如有異常會(huì)在顯示屏上提示。

3. 軟件連接
   若儀器為電腦控制型，需先啟動(dòng)配套軟件（如Applied Biosystems? QuantStudio?系列軟件），確保與主機(jī)通訊正常。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與耗材選擇

1. 試劑與耗材

• 選擇與儀器匹配的反應(yīng)管、八聯(lián)管或96/384孔板，透明或半透明材質(zhì)以保證熒光信號(hào)傳輸。

• 使用高質(zhì)量光學(xué)平蓋膜或透明蓋，防止蒸發(fā)并減少熒光信號(hào)干擾。

• 反應(yīng)體系中使用專用qPCR Master Mix、ROX參考染料（若體系需要）及高純度引物探針。

2. 樣品準(zhǔn)備

• 模板DNA/RNA需純度高、無(wú)蛋白質(zhì)或有機(jī)溶劑污染，A260/A280比值應(yīng)在1.8–2.0之間。

• 若為RNA樣品，需經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，并盡量減少凍融循環(huán)次數(shù)。

3. 工作區(qū)與防污染
   分區(qū)操作：試劑準(zhǔn)備區(qū)、模板處理區(qū)、擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)分開(kāi)，使用專用移液器及濾芯吸頭，防止氣溶膠交叉污染。

三、反應(yīng)體系配置

1. 體系組成
   常用反應(yīng)體系為10–50 μL，包括：

• 2× qPCR Master Mix：含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl?、緩沖液及熒光染料（SYBR Green或探針）

• 上下游引物（0.2–0.5 μM）

• 探針（若使用TaqMan等探針?lè)?，濃度一般?.1–0.25 μM）

• 模板DNA/cDNA（通常為1–100 ng）

• 無(wú)RNAse/DNAse水補(bǔ)足體積

2. 配制步驟

• 先在冰上配置主混合液（Master Mix），將所有除模板外的成分混勻。

• 分裝至各反應(yīng)管/孔中，再加入模板，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

• 封膜或加蓋，確保密封嚴(yán)實(shí)。

四、程序設(shè)定

1. 溫控程序
   根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇程序模式。常規(guī)SYBR Green法典型程序：

   若為探針?lè)?，通常不需熔解曲線分析。

• 變性：95℃，10–15 s

• 退火/延伸：60℃，30–60 s（熒光采集）

• 預(yù)變性：95℃，2–10 min（激活Taq酶）

• 循環(huán)（40–45個(gè)循環(huán)）：

• 熔解曲線分析：從60℃逐漸升至95℃，每0.3–0.5℃采集一次熒光。

2. 熒光通道選擇

• SYBR Green法選擇FAM通道。

• 多重檢測(cè)需根據(jù)探針標(biāo)記熒光素選擇不同通道（如 VIC、ROX、Cy5 等），并在軟件中正確設(shè)置。

3. 樣品信息錄入
   在軟件中建立板布局文件（Plate Layout），錄入樣品編號(hào)、分組、標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度梯度等信息。

五、運(yùn)行與監(jiān)控

1. 放置樣品

• 將反應(yīng)管/板放入樣品槽中，位置對(duì)準(zhǔn)，保持平衡。

• 使用平衡管補(bǔ)齊空位，避免熱不均。

2. 運(yùn)行反應(yīng)

• 在軟件中確認(rèn)程序設(shè)置無(wú)誤，點(diǎn)擊“開(kāi)始”運(yùn)行。

• 反應(yīng)過(guò)程中，實(shí)時(shí)熒光曲線會(huì)逐步生成，可監(jiān)控?cái)U(kuò)增情況。

3. 運(yùn)行注意事項(xiàng)

• 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡量避免觸碰儀器，防止震動(dòng)影響光路穩(wěn)定。

• 若發(fā)現(xiàn)異常曲線，可暫停并檢查樣品位置、光學(xué)元件是否清潔。

六、數(shù)據(jù)分析

1. 閾值與基線設(shè)置
   軟件可自動(dòng)設(shè)定閾值和基線，也可根據(jù)對(duì)照組曲線人工調(diào)整，確保Ct值判定合理。

2. 擴(kuò)增曲線解讀

• 正常曲線應(yīng)呈S形，Ct值在重復(fù)孔間差異不超過(guò)0.5。

• 若曲線拖尾或有多個(gè)峰，可能存在引物二聚體或非特異性擴(kuò)增。

3. 熔解曲線分析

• 單一尖銳峰表示擴(kuò)增產(chǎn)物單一。

• 多峰或低溫峰提示有引物二聚體或非特異性產(chǎn)物。

4. 定量分析

• 絕對(duì)定量：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算拷貝數(shù)。

• 相對(duì)定量：以內(nèi)參基因（如GAPDH、β-actin）歸一化，使用2^-ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)倍數(shù)變化。

七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與關(guān)機(jī)

1. 取出樣品
   反應(yīng)結(jié)束后，戴手套取出反應(yīng)管/板，避免接觸光學(xué)元件。

2. 清潔與維護(hù)

• 檢查樣品槽是否有溢液，如有立即用無(wú)水乙醇或?qū)Ｓ们鍧嵅疾潦谩?/p>

• 光學(xué)透鏡保持清潔，避免用手直接觸碰。

3. 關(guān)機(jī)
   關(guān)閉軟件→關(guān)閉儀器電源→切斷電源總開(kāi)關(guān)。
   若連續(xù)使用，可保持儀器待機(jī)狀態(tài)，減少燈源頻繁啟停。

八、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法

九、安全注意事項(xiàng)

1. 避免直接暴露在熒光激發(fā)光下，保護(hù)眼睛。

2. 所有生物樣品均視為潛在感染源，需符合生物安全規(guī)范操作。

3. 使用化學(xué)染料和清潔劑時(shí)，注意佩戴手套、口罩。

十、使用技巧與優(yōu)化建議

1. 試劑預(yù)混：減少移液次數(shù)，降低系統(tǒng)誤差。

2. 板封膜前離心：去除氣泡，保證光路穩(wěn)定。

3. 多重定量?jī)?yōu)化：盡量選擇熒光光譜分離度大的探針，減少通道串?dāng)_。

4. 溫度梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)：尋找最佳退火溫度，提高特異性。

5. 定期校準(zhǔn)：建議每年進(jìn)行溫控與光學(xué)系統(tǒng)的校準(zhǔn)，保持檢測(cè)準(zhǔn)確性。