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質(zhì)保3年只換不修，廠家長沙實了個驗儀器制造有限公司。
伯樂（Bio-Rad）Gene Pulser Xcell 電穿孔儀是一款用于基因?qū)?、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及細胞轉(zhuǎn)染的高性能設(shè)備。其工作原理是通過短暫高壓脈沖作用，使細胞膜瞬時形成可逆性微孔，使外源DNA、RNA或蛋白質(zhì)等大分子進入細胞內(nèi)部。要想獲得理想的轉(zhuǎn)化效率，樣本準備 是整個實驗流程中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。
樣本準備不僅包括細胞的預(yù)處理與感受態(tài)制備，還涉及質(zhì)粒或核酸樣品的純化、緩沖體系的優(yōu)化、樣品溫度控制及雜質(zhì)去除等多個方面。任何微小的偏差都可能導(dǎo)致電弧放電、細胞死亡或轉(zhuǎn)化效率下降。因此，系統(tǒng)、標準化的樣本準備是保障電穿孔實驗成功率的前提。
電穿孔是一種精細的物理導(dǎo)入方法，實驗中所有參數(shù)均依賴于樣本狀態(tài)。若細胞濃度、溶液電導(dǎo)率或DNA純度不符合要求，將直接影響膜電勢變化與孔洞形成。良好的樣本準備能夠：
提高細胞存活率：避免因離子濃度過高造成的過度放電或熱損傷；
提高轉(zhuǎn)化效率：確保DNA能順利進入細胞并在復(fù)蘇期完成整合；
減少實驗誤差：提高不同實驗間的重復(fù)性和可比性；
延長儀器壽命：防止電弧放電造成電極損傷。
在 Gene Pulser Xcell 系統(tǒng)中，樣本準備需遵循以下總體要求：
低電導(dǎo)率：樣品溶液必須去離子化，避免鹽分殘留；
低溫操作：操作應(yīng)在冰上完成，保持4℃環(huán)境以減少細胞應(yīng)激；
無氣泡與雜質(zhì)：氣泡會導(dǎo)致電場集中，引起電??；
均勻混合：DNA或RNA與感受態(tài)細胞應(yīng)充分混勻但避免劇烈震蕩；
快速處理：混合樣品應(yīng)立即進行電擊，防止膜電位變化失衡。
以大腸桿菌（E. coli）為代表的原核細胞體積小、膜厚、對電擊耐受性高。
特點：
易制備高活性感受態(tài)；
轉(zhuǎn)化效率受鹽濃度與電場強度影響明顯；
使用 0.1 cm 或 0.2 cm 電穿孔杯效果較好。
細胞壁較厚，導(dǎo)入效率低于細菌，但可通過酶解預(yù)處理改善。
特點：
需去除細胞壁或使用酶解法形成原生質(zhì)體；
含高滲保護劑（如山梨醇、甘露醇）以維持形態(tài)；
電壓與電容需高于細菌體系。
膜結(jié)構(gòu)脆弱，對電擊極為敏感。
特點：
需在等滲緩沖液中處理；
方波模式優(yōu)于指數(shù)衰減波；
電擊后迅速復(fù)蘇以提高存活率。
去壁細胞，體積大，需中強度電場。
特點：
操作環(huán)境需高滲；
細胞數(shù)量控制精確；
電擊后需補充Ca2?促進膜修復(fù)。
以大腸桿菌為例：
步驟
取單克隆菌落接種入5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜；
次日1:100比例接種入新鮮LB培養(yǎng)基；
培養(yǎng)至OD600≈0.5（對數(shù)生長期）；
置冰上冷卻10 min以抑制代謝；
4℃、4000 rpm離心10 min，棄上清；
用預(yù)冷無菌10%甘油溶液洗滌三次；
最終重懸于少量10%甘油中（約2×10? cells/mL）；
分裝至無菌離心管，置冰上待用或-80℃保存。
注意事項
培養(yǎng)基必須不含鹽（NaCl等）殘留；
洗滌液使用無離子甘油可顯著降低電導(dǎo)；
細胞狀態(tài)對電轉(zhuǎn)化效率影響顯著，過老或過嫩均不宜使用。
步驟
培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集細胞；
用1.2 M山梨醇緩沖液洗滌2次；
以溶壁酶或Zymolyase處理30 min制備原生質(zhì)體；
再次離心洗滌并重懸于高滲緩沖液中；
置冰上備用。
要點
原生質(zhì)體制備需在無菌條件下完成；
電穿孔時液體體積控制在40–60 μL；
電擊后立即加入山梨醇復(fù)蘇液防止破裂。
準備步驟
將細胞培養(yǎng)至70–80%融合度；
使用胰酶輕柔消化，離心收集；
用無Ca2?、無Mg2? PBS洗滌2次；
重懸于等滲電穿孔緩沖液（如Cytoporation Buffer）中；
計數(shù)調(diào)整至1×10? cells/mL；
放置冰上備用。
注意事項
避免細胞聚集或氣泡；
所有緩沖液需過濾除菌；
不可使用含血清或鹽分高的培養(yǎng)液。
電穿孔對DNA純度要求極高。
要求與處理：
純度A260/A280應(yīng)在1.8–2.0；
徹底脫鹽，避免任何Tris、NaCl、EDTA殘留；
溶解介質(zhì)推薦無離子水或低離子緩沖液（如TE 1:100稀釋）；
儲存于-20℃，使用前置冰解凍。
濃度建議
對細菌：10–100 ng/μL；
對動物細胞：1–5 μg/mL；
過高濃度會導(dǎo)致電導(dǎo)率上升，增加電弧風(fēng)險。
RNA或蛋白轉(zhuǎn)染樣品應(yīng)保持結(jié)構(gòu)完整。
RNA樣品需避免RNase污染；
蛋白樣品應(yīng)保持緩沖液電導(dǎo)率低且pH 7.0–7.4；
可在電擊前加入穩(wěn)定劑如甘油或蔗糖以保護樣品。
一般情況下，DNA與感受態(tài)細胞體積比例為1:20至1:40。
例如：
40 μL細胞 + 1–2 μL DNA。
將感受態(tài)細胞加入至預(yù)冷電穿孔杯；
加入DNA樣品輕輕混勻；
確保液面平整無氣泡；
放置冰上待電擊，不超過2分鐘。
所有操作均應(yīng)在冰上完成；
混合后應(yīng)立即進行電擊；
若出現(xiàn)氣泡，應(yīng)棄樣重新配制。
電穿孔過程中能量釋放迅速，會導(dǎo)致局部加熱。若樣本溫度過高，細胞會迅速死亡。
溫度控制措施：
電擊前樣品保持在0–4℃；
電擊后立即加入預(yù)溫復(fù)蘇液（37℃），避免溫差沖擊；
每次電擊間隔至少5分鐘，使電極降溫。
離子濃度控制：
使用去離子水或低離子甘油溶液制備細胞懸液；
避免NaCl、KCl、Tris等強電解質(zhì)；
若必須加入離子組分，應(yīng)控制在1–5 mM以下。
立即復(fù)蘇
電擊結(jié)束后，在杯中迅速加入1 mL預(yù)溫SOC或特定復(fù)蘇液；
輕柔混勻
避免劇烈搖動，防止受損細胞破裂；
復(fù)蘇培養(yǎng)
對細菌：37℃搖床復(fù)蘇1小時；
對動物細胞：37℃、5% CO?培養(yǎng)2–4小時后更換新培養(yǎng)基；
檢測與保存
電轉(zhuǎn)后取部分樣品接種平板驗證陽性克隆；
余下樣品可冷凍保存以供分析。
| 問題 | 可能原因 | 解決措施 |
|---|---|---|
| 電弧放電 | 樣品鹽濃度過高或有氣泡 | 徹底脫鹽、排氣泡 |
| 無菌落生成 | 電壓過高或細胞死亡 | 降低電壓或縮短脈沖 |
| 轉(zhuǎn)化率低 | DNA質(zhì)量差或濃度不當 | 重新純化DNA、優(yōu)化比例 |
| 樣品加熱 | 電容過大或脈沖過長 | 減小電容值 |
| 波形異常 | 電極污染或樣品量不符 | 清潔杯體、重新配樣 |
在樣本準備過程中，應(yīng)建立詳細記錄表，包括：
樣品編號與制備時間；
感受態(tài)細胞OD值與保存條件；
DNA濃度與純度；
電擊參數(shù)及時間常數(shù)；
電擊前后樣品體積與溫度。
記錄數(shù)據(jù)用于質(zhì)量追蹤與后期實驗優(yōu)化。
隨著實驗室自動化的發(fā)展，部分樣本制備流程已可通過機器人系統(tǒng)實現(xiàn)。
未來優(yōu)化方向包括：
自動溫控與攪拌系統(tǒng)：確?；旌暇鶆蚯覝囟群愣ǎ?/p>
微流控上樣系統(tǒng)：精確控制電場作用體積；
低離子仿生緩沖液：在保持生理穩(wěn)定的同時減少電導(dǎo)率；
預(yù)警檢測機制：實時監(jiān)控導(dǎo)電率與溫度，防止電弧。
長沙實了個驗儀器制造有限公司 為伯樂 Gene Pulser Xcell 系列設(shè)備的授權(quán)技術(shù)服務(wù)單位，提供：
原廠耗材供應(yīng)與電穿孔杯更換；
樣品制備指導(dǎo)與標準操作培訓(xùn)；
定期校正與性能檢測；
三年質(zhì)保，只換不修，確保實驗安全高效；
提供定制化參數(shù)優(yōu)化方案。
該服務(wù)體系確?？蒲腥藛T在樣本準備與儀器使用全過程中獲得專業(yè)技術(shù)保障。
樣本準備是電穿孔實驗的核心環(huán)節(jié)。無論是細胞活性、DNA純度、緩沖液組成，還是溫度與離子濃度的控制，均直接影響導(dǎo)入效果。
通過科學(xué)、系統(tǒng)的準備流程，可顯著提升實驗穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)化效率。Gene Pulser Xcell 電穿孔儀憑借精準的脈沖控制與可靠的硬件系統(tǒng)，為各種細胞類型的基因?qū)胩峁├硐肫脚_。在廠家長沙實了個驗儀器制造有限公司的技術(shù)支持與質(zhì)保體系下，研究人員能夠安全、穩(wěn)定地開展長期實驗工作，確保數(shù)據(jù)真實可靠。
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